微波法提取虫草素研究

夏 敏1 ，温 鲁2 、

(1.淮阴师范学院化学系分析测试中心，江苏 淮安 223300； 2.淮阴师范学院生物系，江苏 淮安 223300)

摘 要：对蛹虫草固体培养物中的虫草素进行微波提取，用 HPLC 法测定提取液中的虫草素含量，通过正交试验， 确定了微波提取虫草素的最佳条件为：提取液用量 10ml，固液比 1:200，中火处理 3min，样品中虫草素的测定值 达 12.16mg/g。本法提取时间仅为超声波提取的 1/40，且提取率高于超声波提取。 关键词：微波提取；虫草素；正交试验；HPLC

由表 3 可看出，随着淀粉乙酰基含量的增加，冻 融稳定性随之增加。这是由于醋酸酯化淀粉引入了亲水 的乙酰基团，可以与水分子更好地水合，另一方面与 支链淀粉的脱水葡萄糖羟基形成分子内氢键，阻碍了支 链淀粉分子间氢键生成，分子间空间阻碍增大，使分 子之间不易重新排列和缔合，冻融稳定性得到改善[5]。

3 结 论 制备红薯酯化淀粉的最佳条件为：p H 值为 9.25 、 醋酸酐用量 10.0%、反应温度 2 5℃，反应时间 2.5h，此时反应效率可达 72.59%，醋酸酯化淀粉乙酰基含量 为 3.17% 。通过红外结构表征，验证了酯化反应的发 生。酯化淀粉糊的透光度、溶解度、膨胀率、冻融 稳定性均比原红薯淀粉有明显提高。

参考文献：

[1] 于泓鹏, 朱婉怡, 高群玉, 等. 食用醋酸酯淀粉制备和性质的研究[J]. 食品科学, 2003, 24(7): 51-55.

[2] 孙建平, 吴洪才, 胡友慧. 酯化变性淀粉的制备与应用性能[J]. 高分 子材料科学与工程, 2003, 19(3): 102-105.

[3] Mahmoud Z, Sitohy，Said S EI-Saadony. Physicochemical properties of different types of starch phosphate monoesters[J]. Starch/Starke, 2000, 52(4): 101-105.

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[5] 林丽. 木薯淀粉磷酸酯的结构表征及理化性质研究[D]. 南宁: 广西 大学, 2005. 28-49.

虫草素是蛹虫草的主要活性成分之一，能抑制枯草 杆菌、鸟结核杆菌等，对小鼠艾氏腹水癌、人鼻咽癌 K B 细胞及小鼠 S 180 瘤细胞均有抑制作用[1]，有着抗菌、 抗病毒、抗肿瘤，以及抗疲劳、抗衰老、提高人体 免疫力等显著功效，并有明显的雄性激素样作用[2]，其 含量多少是衡量虫草品质高低的重要依据。目前对虫草 多采用超声波来提取虫草素[1][3]，用高效液相色谱法测定 含量[2,3]。近年来，有人把微波技术用于天然产物的提 取，如李嵘试验用微波法提取银杏黄酮甙[4]，陈代武[5] 试验用微波辅助萃取－ HPLC 测定洋葱槲皮素等，均有 较好效果。我们用蒸馏水作浸提溶剂，利用家用微波 炉对样品进行微波处理，用 HPLC 法测定提取液中的虫 草素，建立了微波提取－ HPLC 法测定蛹虫草固体培养 物中虫草素的新方法。此法简单、快速，提取效率较 超声波大为提高，可在科研和生产实践中使用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品与试剂

待测样品 蛹虫草固体培养物3# ，由淮阴师范学院 生物系提供；虫草素对照品 上海化学试剂公司进口分 装；其余所用试剂为国产分析纯；用水为三次蒸馏水。 1.1.2 仪器 KD23B-AE 型微波炉 美的微波炉制造有限公司； KS-300D 型超声波清洗仪 宁波科生仪器厂；电子精密 天平 上海奥豪斯公司；美国 Waters 高效液相色谱仪 系统(600E pump，600controller，2487紫外检测器，InLine Degasser AF 在线脱气机，Empower 色谱数据管理 系统) 美国 Waters 公司；DHG-9240A 型电热恒温鼓风 干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；JYL-350 型多功 能食品料理机 山东九阳小家电有限公司；其余仪器均 为实验室常规仪器。

1.2 方法

1.2.1 微波处理预试验

取一批规格相同的试剂瓶，每 6 瓶一组，每瓶加 25ml 自来水，不加塞，在微波炉中围绕圆盘中心均匀 排成 1 圈，保证每瓶接受的微波剂量相同。每组分别用 低火(P10)、中低火(P30)、中火(P50)、中高火(P80)进行 处理，观察到样品在低火下10min 不沸腾，中低火8.0min 不沸腾，中火 3.5min 不沸腾，中高火 2.5min 不沸腾。 以下提取试验，各微波强度所用时间，均不超过该强 度使水沸腾的时间。

1.2.2 微波提取

将蛹虫草固体培养物用 6 0 ℃低温烘干，粉碎，精 密称取培养物粉末 0.2500g，放入试剂瓶中，加 25.00ml

蒸馏水，轻轻摇匀，将瓶塞放在瓶口上(不要塞紧)。每 个样品瓶配 5 瓶盛有 25.00ml 蒸馏水的空白瓶，在微波炉 中排成一圈进行处理。

1.2.2.1 不同微波强度和处理时间试验

微波强度设置为低火、中低火、中火、中高火， 处理时间设置为 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3、4、 5min。在用微波处理前，每个样品瓶所配 5 瓶空白瓶， 均需凉至室温，以减少试验误差。

1.2.2.2 不同加液量试验

将固液比定为 1:100，依次向 5 个试剂瓶中加入 0.1000、0.2000、0.2500、0.3000 和 0.4000g 样品，再 依次加 10.00、20.00、25.00、30.00、40.00ml 蒸馏水， 配 1 瓶空白瓶，同时用中火处理 2min 。

1.2.2.3 不同固液比试验

将加液量定为 25ml，分别称取 0.5000、0.2500、 0.1670 和 0.1250g 样品，放入 4 个试剂瓶中，每瓶加 25.00ml蒸馏水，各瓶固液比依次为1:50、1:100、1:150、 1:200，配 2 瓶空白瓶，同时用中火处理 2min。

1.2.3 超声波提取

向若干试剂瓶中各加 0.2500g 样品，再加 25.00ml 水，一起放入超声波振荡仪进行超声处理，分别在处 理 3 0、6 0、9 0 和 120min 时取出样品瓶。

1.2.4 微波提取正交试验

根据1.2.2.1、1.2.2.2和1.2.2.3的试验结果，选择微 波强度、处理时间、加液量和固液比四个因子，各取 三个水平，采用 L9( 34)正交表进行正交试验。各因子和 水平见表 1 。

1.2.5 含量测定

1.2.5.1 色谱条件

色谱柱为 Waters Nova-pak C18，3.9mm × 300mm， 4μm；流动相为 K H 2 P O 4 - K 2 HPO 4 缓冲液(0.01mol/L， pH6.86)+1% 四氢呋喃；等度洗脱；流速 1.00ml/min； 柱温为室温；检测波长 260nm 。

1.2.5.2 提取液测定

在选定色谱条件下，取虫草素对照品溶液 1 0μl 进 样分析，色谱图见图 1 ，以峰面积对含量作线性回归， 得回归方程为 Y=4.46e+006X+7.43e+003，r=0.99995。取样品提取液用滤纸过滤，滤液再经 0.2μm 微孔滤膜压 滤，1 0μl 进样分析，色谱图见图 2 。以对照品的保留 时间定性、外标法定量，计算提取液的虫草素含量， 再根据固液比求出样品中的虫草素含量。

2 结果与分析

2.1 不同微波强度和处理时间的提取效果

提取结果见表 2 。

从表 2 可知，用低火和中低火处理，随着处理时 间延长，虫草素提取量逐步增加，若继续延长处理时 间，还将进一步增加，但增加幅度放缓(试验中 P10 已 处理到 10min，P30 处理到 8min，但未在表中列出)，且均未超过中火处理的最大值；中火处理在 2min 时出现最 大值，延长处理时间，虫草素提取量有小幅回落；中 高火处理的最大值在 1.5min，但仍低于中火的最大值， 延长时间虫草素提取量并未增加，而液体已接近沸腾。 综合考虑微波强度和处理时间，用中火处理 2 ～3min， 对虫草素的提取最为有利。

2.2 不同加液量的提取效果

提取结果见表 3 。

在相同固液比的条件下，随着原料和提取液用量的 增多，单位质量的被处理物所受微波剂量减少，因而 虫草素的提取量降低。上表显示，用10.00ml水对0.1000g 样品进行微波提取，效果最好。

2.3 不同固液比的提取效果

试验结果见表 4 。

结果表明，不同固液比对虫草素的提取效果有影 响，固液比大，提取效果好，以固液比 1:200 提取虫 草素的效果最好。

2.4 超声波的提取效果

测定结果见表 5 。

随着超声处理时间的延长，虫草素提取量逐渐增加，但即使处理 120min，也未超过微波中火处理 2min 提取量(在相同固液比和加液量的条件下，见表 2 )，再延长时间已无意义。超声较水浴和回流浸提时间短、提 取率高，但与微波处理相比，微波提取的时间更短、 提取率更高，而且设备更普通( 普通家用微波炉即可使 用) ，具有更好的应用前景。

2.5 微波提取正交试验结果

试验根据四因子三水平设计了 9 个组合，结果和分 析见表 6 。

表中各列 K 1～K 3 值为各因子每个水平所得结果(虫 草素测定值)的和，k1～k3 为各因子每个水平的算术平均 值，R 为同一因子 3 个平均值的全距(最大值减最小值)。 由全距可知，加液量最小，为次要因子；固液比、微波处理时间和微波强度均很大，为主要因子，其不同 水平对虫草素的提取有较大影响。

从表 6 还可看出，组合 8(A3B2C1D3)的提取效果最好， 为 11.70mg/g；组合 6(A2B3C1D2)次之，为 11.55mg/g。各 因子的不同水平中，分别以 A 3 、B 3 、C 1 、D 3 为最优 水平，但其组合 A 3 B 3 C 1D 3 未包括在参加试验的 9 个组合 中。为此，加做一个该组合处理，测得虫草素含量为12.16mg/g，证明该组合确是优于 A3B2C1 D3 和 A2 B3C1D2 的最佳组合。

3 讨 论

3.1 用微波提取虫草素，与超声波提取虫草素相比， 具有提取时间短(是超声波提取的1/60～1/40)、提取效果 好、设备简单易得等优点，是比超声波提取更理想的 虫草素提取新方法。

3.2 用 HPLC 测定虫草素，在文中介绍的色谱条件下， 虫草素色谱峰与其它色谱峰得到很好分离，标准曲线的 线性关系也很好，回归系数为 0.99995，结合虫草素的 微波提取法，可用于生产上蛹虫草及其固体培养物的质 量控制和产品检测。

3.3 本研究只对蛹虫草固体培养物进行一次微波处理， 如作两次处理，提取率会更高。

3.4 本研究采用价廉易得的蒸馏水作为虫草素的浸提溶 剂，其它溶剂对虫草素的提取研究将另文报告。

参考文献：

[1] 候淑丽, 赵风阁. 十年来蛹草的成分及药理研究概述[J]. 长春中医 学院学报, 1997, 13(6): 64-66.

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